پایان نامه بررسی ساختار تنوع ژنتیکی جمعیت های گندم نیای وحشی Aegilops crassa در ایران

پایان­نامه کارشناسی ارشد در رشته کشاورزی (اصلاح نباتات)

عنوان:

بررسی ساختار تنوع ژنتیکی جمعیت های گندم نیای وحشی Aegilops crassa در ایران با استفاده از نشانگرهای بین ریزماهواره ژنومی و صفات ریختی

با فرمت قابل ویرایش word

تعداد صفحات: 116  صفحه

تکه های از متن به عنوان نمونه :

چکیده

     گیاه Aegilops crassa ،دارای دو سیتوتیپ تتراپلوئید وهگزاپلوئید با ژنوم ( 2n=2x=28 M^crM^crD^cr1D^cr1 ) و (2n=6x=42 M^crM^crD^cr1D^cr1 D^cr2D^cr2  ) است. این گیاه  یکساله و متعلق به خانواده گرامینه و طایفه Triticeae می باشد. بررسی تنوع ژنتیکی در ژرم­پلاسم گیاهی پیش­نیاز هر برنامه­ی اصلاحی یا حفاظتی گیاهان است. این تحقیق به منظور بررسی تنوع ژنتیکی بین 16 جمعیت Ae.crassa با استفاده از 10 آغازگر ISSR انجام شد. DNA ژنومی از گونه­ها در مرحله­ی دو تا سه برگی به روش CTAB با اندکی تغییرات استخراج و نتایج تکثیر با آغازگرهای مختلف روی ژل آگاروز 5/1 درصد مشاهده شدند. باندهای تکثیر شده به صورت حضور باند (یک) و عدم حضور باند (صفر) امتیازدهی و با نرم­افزارهای مولکولی و آماری، تجزیه و تحلیل داده­ها  انجام گرفت. همچنین این آزمایش در قالب طرح آزمایشی اگمنت (در 3 بلوک) در مزرعه تحقیقاتی دانشکده کشاورزی دانشگاه ایلام انجام شد. از میان نمونه‌های ارزیابی شده سه نمونه که دارای بذر بیشتری بودند به عنوان شاهد استفاده شدند. نتایج تکثیر DNA ژنومی با استفاده از آغازگرهای ISSR، در مجموع 105 آلل تولید کرد که از این تعداد 86 آلل (9/81 درصد)، به عنوان آلل چندشکل تشخیص داده شد. اندازه آلل­های تکثیر شده از 190 (آغازگر UBC840) تا 1500 جفت باز (آغازگر 12،14) بود. محتوای اطلاعات چندشکلی از 17/0 در آغازگر UBC842 تا 34/0 برای آغازگر 12 متفاوت بود. همچنین با استفاده از نشانگر ISSR به ترتیب بیشترین و کم­ترین درصد باندهای چندشکل در جمعیت IUGB-00319 (05/39 درصد) و IUGB-01564 (48/10درصد) مشاهده گردید. جمعیت IUGB-00319 بالاترین شاخص تصحیح شده هتروژنی و میزان شاخص شانون را به خود اختصاص داد. آنالیز واریانس مولکولی نشان داد که سطح بیشتری از تنوع به درون جمعیت­ها (53 درصد) تعلق داشت، درحالی که (47 درصد) تنوع در بین جمعیت­ها مشاهده گردید. همچنین تجزیه خوشه ای داده‌ها با استفاده از ماتریس شاخص Nei با الگوریتم Nj انجام شد. دندروگرام بدست آمده جمعیت­ها را به سه گروه و زیر گروه­هایی تقسیم نمود و تا حدی عدم ارتباط بین تنوع مولکولی و تنوع جغرافیایی را نشان داد. نتایج این تحقیق نشان می­دهد که نشانگرهای ISSR برای ارزیابی میزان تنوع ژنتیکی در آژیلوپس کراسا مفید است.

کلیدواژه: نشانگرISSR، ، تنوع ژنتیکی، گونه Ae.crassa ، طرح آگمنت

فهرست مطالب

فهرست جدول­ها……………… ص

فهرست شکل­ها……… ط

فصل اول (مقدمه و اهداف)……….. 1

 1-1- مقدمه………….. 2

1-2- اهداف……….. 7

فصل دوم (کلیات و مرور منابع)…… 8

2-1- اهمیت منابع ژنتیکی.. 9

2-2- طبقه بندی منابع ژنتیکی گیاهی.. 9

2-2-1- گونه‌های وحشی.. 9

 2-2-2-گونه های زراعی.. 10

2-3- مناطق پراکنش جنس آژیلوپس.. 10

2-4- مناطق پراکنش گونه Ae.crassa. 11

2-5- طبقه بندی گونه Ae.crassa. 11

2-6- تنوع ژنتیکی و اهمیت شناخت آن .. 12

2-7- منشاء تنوع ژنتیکی……………………………………………………………..13

2-8- اهمیت بررسی تنوع ژنتیکی…. 13

2-9- کاربردهای بررسی تنوع ژنتیکی.. 14

2-9-1- بررسی­های فیلوژنتیکی…. 14

2-9-2- ژنتیک جمعیت………………. 14

2-9-3-مدیریت گیاهان وحشی………… 14

2-9-4- مدیریت منابع ژنتیکی……….. 15

2-9-4-1- کلکسیون های ذخائر ژنتیک گیاهی…… 15

2-9-4-1- کنترل بیماری­های گیاهی…….. 15

2-10- روش های ارزیابی تنوع ژنتیکی…… 16

2-11- نشانگرهای ژنتیکی….. 16

2-11-1- نشانگرهای مورفولوژیک.. 16

2-11-2- مزایا و معایب نشانگرهای مورفولوژیک.. 17

2-11-3- نشانگرهای مولکولی.. 18

2-11-3-1- خصوصیات مناسب یک نشانگر مولکولی.. 19

2-11-3- 2-اهمیت نشانگرهای مولکولی DNA.. 19

2-11-3-3- نشانگرهای بیوشیمیایی……………………………………… 20

2-11-3-4- نشانگرهای مبتنی بر DNA………………………………… 20

2-11-3-5- نشانگرهای DNA  غیر مبتنی بر PCR………… 21

2-11-3-6- نشانگرهای DNA  مبتنی بر PCR………………….. 22

2-11-3-7-  نشانگرهای DNA  مبتنی بر PCR  هدفمند و توالی یابی    22

2-12- نشانگرهای مولکولی ISSR……. 23

2-12-1- علل ایجاد چندشکلی حاصل از نشانگر مولکولی ISSR  25

2-12-1-1- نمونه DNA.. 25

2-12-1-2- ماهیت آغازگر.. 25

2-12-1-3- روش مورد استفاده برای تشخیص باندها.. 26

2-12-2- مزایای نشانگرهای ISSR.. 26

2-12-2-1- تکرارپذیری بسیار بالا.. 26

2-12-2-2- دقت بالا……….. 27

2-12-2-3- تنوع بالا……………… 27

2-12-2-4-  هزینه پایین…..27

2-12-2-5- سرعت و سهولت اجرا……. 27

2-12-3- معایب نشانگرهای ISSR……………. 27

2-12- 4- انواع نشانگرهای ISSR……. 28

2-12-4-1-تکنیک MP-PCR 28

2-12-4-2- تکنیک F-ISSR.. 28

2-12-5-کاربرد نشانگرهای مولکولی ISSR.. 29

2-12-5-1- انگشت­نگاری ژنومی .. 29

2-12-5-2-   مطالعات تنوع ژنتیکی و تجزیه و تحلیل فیلوژنتیکی   29

2-12-5-3-  نقشه­یابی ژنتیکی.. 30

2-12-5-4-  نشانمند کردن ژن و انتخاب به کمک نشانگر.. 30

2-12-5-5- مشخص کردن فراوانی توالی­های ریزماهواره­ای 30

2-12-5-6- کاربرد نشانگرهای  ISSR در شناسایی و رده­بندی گونه­ها   31

2-13- تجزیه و تحلیل تنوع ژنتیکی.. 31

2-14- تخمین فاصله ژنتیکی.. 32

2-14- 1- روش گروهبندی افراد یا جمعیت ها.. 32

2-14-1-1-تجزیه خوشه ای.. 33

2-14-1-2- تجزیه به مختصات اصلی (PCoA).. 34

2-14-2-  معیارهای سودمندی نشانگرها.. 34

2-14-2-1- محتوی اطلاعات چندشکلی.. 34

2-14-2-2-  احتمال همسانی.. 35

2-14-2-3-  قدرت تفکیک.. 35

2-15- مروری بر مطالعات ژنتیکی  و مورفولوژی انجام شده روی گونه های آژیلوپس.. 35

فصل سوم (مواد و روشها)…. 40

3 -1- مواد گیاهی.. 41

3-2- آغازگرها.. 43

3-3-  مکان و زمان انجام آزمایش مولکولی.. 43

3-4- عملیات زراعی.. 44

3 -4-1- مشخصات جغرافیایی محل انجام آزمایش مزرعه‌ای.. 44

3 -4- 2- طرح آزمایشی و مراحل اجرای آن.. 44

3 -5- استخراج DNA ژنومی.. 45

3-6- تعیین کمیت نمونه های DNA  ژنومی.. 47

3 -7- تعیین کیفیت نمونه های DNA ژنومی.. 48

3 -8- روش تهیه آگاروز 8/0و 5/1 درصد برای تعیین کمیت وکیفیت و تفکیک قطعات تکثیر شده.. 48

3-9- آماده سازی نمونه ها واجرای الکتروفورز ژل آگاروز   49

3-10- اجزای واکنش زنجیره ای پلیمراز.. 50

3-11- سیکل حرارتی و مراحل واکنش زنجیره­ای پلیمراز.. 50

3 -12-توان و زمان مورد نیاز برای الکتروفورز محصول PCR   51

3 -13- مواد تشکیل دهنده بافرTE.. 52

3-14- تهیه بافر  TAE10X.. 52

3 -15- اتیدیوم بروماید.. 53

3 -16- رنگ بارگذاری.. 53

3 -17- مراحل رنگ آمیزی تا ظاهرسازی قطعات تکثیر شده   53

3-18- تجزیه وتحلیل داده ها.. 54

3-18-1- امتیازبندی باندهای حاصل از داده های مولکولی   54

3-18-2- تجزیه خوشه ای و آنالیز مولکولی……..54

فصل چهارم(بحث و نتیجه­گیری)……55

 4-1- نتایج استخراج DNA ژنومی.. 56

4 -2- نتایج واکنش زنجیره­ای پلیمراز.. 56

4 -3- محاسبه چندشکلی نشانگرهای ISSR.. 58

4-4- محاسبه محتوای اطلاعات چندشکلی نشانگرهای ISSR   59

4-5- محاسبه شاخص نشانگر(MI) نشانگرهای ISSR…………60

4 -5- محاسبه ضرایب همبستگی کوفنتیک.. 61

4-6- ترسیم دندروگرام جمعیت­های Ae.crassa. 62

4-7- تجزیه به مختصات اصلی با استفاده از نرم­افزار DARWin  وترسیم نمودار سه بعدی جمعیت­ها با نرم­افزار Minitab. 63

4-8- محاسبه فاصله ژنتیکی درون و بین جمعیت­های Ae.crassa. 64

4-9- محاسبه ماتریس فاصله و تشابه ژنتیکی شاخص Nei ………66

4 -10- میزان آلل­های چندشکل در جمعیت­های Ae.crassa. 69

4-11- محاسبه شاخص­های ژنتیکی در جمعیت­های Ae.crassa. 70

4 -12- تجزیه واریانس مولکولی.. 71

4-13- بررسی صفات مورفولوژی.. 72

4-13-1- همبستگی ساده فنوتیپی.. 72

4-13-2- تجزیه کلاستر (خوشه­ای)………….74

4-13-3- تجزیه به مولفه های اصلی.. 76

4 -13-4- تجزیه علیت (مسیر).. 78

4-14- نتیجه­گیری کلی مولکولی.. 80

4-15- نتیجه­گیری کلی مورفولوژیکی…..81

4-15-1 پیشنهادات.. 83

 منابع…..……84

مقدمه

ایران یکی از غنی ترین مراکز دنیا از نظر ذخایر ژنتیکی گیاهی محسوب می‌شود. به عقیده گیاهشناسان ایرانی حدود 10 الی 12 هزار گونه گیاهی در ایران وجود دارد که آن را به عنوان یکی از غنی ترین مراکز تنوع ذخایر توارثی گیاهی در جهان ساخته است.گونه های وحشی به لحاظ داشتن ژن های مفید برای مقاومت به تنش های زنده و غیرزنده و گسترش سازگاری ژنتیکی در برابر تغییرات محیطی دارای اهمیت می‌باشند. برای استفاده از این منابع، اطلاع از ماهیت و  میزان تنوع موجود در ژرم‌پلاسم، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است [108] . بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان زراعی برای برنامه های اصلاحی و حفاظت از ذخایر توارثی، حیاتی بوده و اطلاع از سطح تنوع ژنتیکی در گونه گیاهی برای انتخاب والدین جهت رسیدن به هیبرید مناسب از اهمیت زیادی برخوردار است [109]. بررسی تنوع ژنتیکی همچنین از جنبه مدیریت موثر و حفظ منابع ژرم پلاسم دارای اهمیت می‌باشد [96]. روش‌هایی که برای تخمین تنوع ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته‌اند متفاوت می‌باشند. از جمله‌ی آن‌ها می توان ثبت شجره، خصوصیات مورفولوژیکی و نشانگرهای مولکولی را نام برد [41]. آگاهی از تنوع ژنتیکی ژرم‌پلاسم ها معیاری مناسب برای استفاده از آن‌ها در شناسایی و انتقال ژن‌ها در بهبود گیاهان زراعی می‌باشند [41]. تنوع ژنتیکی اساس بیشتر برنامه‌های اصلاحی بوده و انجام گزینش منوط به وجود تنوع ژنتیکی مطلوب از نظر ویژگیهای مورد بررسی می‌باشد [32]. مطالعه تنوع ژنتیکی فرآیندی است که تفاوت یا شباهت گونه‌ها، جمعیت‌ها و یا افراد را با استفاده از روش‌ها و مدل‌های آماری خاص بر اساس صفات مورفولوژیک، اطلاعات شجره‌ای یا خصوصیات مولکولی افراد بیان می‌کنند [32]. تعیین سطح تنوع ژنتیکی یکی از مراحل اساسی در مدیریت مؤثر و استفاده از ذخایر ژنتیکی می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [96،23،7]. منابع ژنتیکی یا ذخایر توارثی به دلیل اهمیت فراوانی که دارند یکی از ارزشمند ترین ثروت های ملی و منابع پایه ای در هر کشور محسوب می‌شوند [1]. یکی از عواقب اصلاح‌نباتات موفق، افزایش فرسایش یا کاهش منابع ژنتیکی گیاهی بوده که تحت برنامه انتخاب قرار گرفته‌اند. در سال های اخیر عوامل بسیار زیادی در فرسایش ژنتیکی و نابودی ذخایر ژرم‌پلاسم نقش داشته‌اند [16]. استفاده از واریته‌های اصلاح شده بجای واریته‌های بومی، اعمال روش‌های مدرن زراعی مانند استفاده از سموم علف‌کش، پیشرفت شهرها و مراکز صنعتی، مسکونی شدن زمین های زراعی و مرتعی، تغییر روش های کشت و سایر عواملی که منجر به فرسایش و انقراض مواد با ارزش می‌شوند که به‌طور مستقیم وغیر مستقیم در کشاورزی و اصلاح نباتات قابل استفاده هستند. بنابراین حفاظت و استفاده از منابع ژنتیکی گیاهی برای بقا و بهبود تولیدات زراعی ضروری بوده و به عنوان نیازی اساسی در توسعه پایدار و کاهش فقر محسوب می‌شود. تنوع ژنتیکی اساس اکثر برنامه های اصلاح نباتات می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [111،74،7]. موفقیت در اصلاح یک گیاه زراعی، در درجه اول به دسترسی تنوع ژنتیکی موجود در آن گیاه بستگی دارد، ضمن اینکه تنوع ژنتیکی یکی از ارکان اصلی کشاورزی پایدار است و وجود تنوع ژنتیکی در نظام‌های زراعی با درس گرفتن از طبیعت باید همواره مد نظر قرار گیرد. مدیریت و استفاده صحیح از تنوع موجود در ارقام محلی و خویشاوندان وحشی یک گونه گیاهی در اجرای برنامه‌های موثر اصلاحی بسیار مهم است. اولین قدم در اصلاح یک گیاه، شناسائی دقیق ساختار ژرم‌پلاسم آن گیاه است که این مطلب خود نمونه‌گیری منظم و دقیق از ژرم‌پلاسم را برای اهداف اصلاحی و حفاظتی امکان پذیر خواهد ساخت. کاهش تنوع علاوه بر کاهش بازده برنامه های اصلاحی، باعث یکنواختی ژنتیکی در مزارع و آسیب‌پذیری شدید محصولات کشاورزی در برابر آفات، بیماری‌ها و تنش‌های محیطی می‌گردد. خویشاوندان وحشی گیاهان، دربردارنده منابع ژنی با ارزش برای مقاومت به تنش‌های زنده و غیرزنده می باشند.

توده‌های وحشی و نژادهای بومی از مهم‌ترین منابع تنوع ژنتیکی در دسترس می‌باشند [26]. اهلی‌سازی جمعیت‌های برتر انتخاب شده از بین تعداد زیادی توده می‌تواند پیشرفت قابل توجهی در تأمین نیاز صنایع وابسته بدون نیاز به روش‌های پرهزینه و گران اصلاحی ایجاد نماید [26]. اهلی‌کردن، فرآیندی طولانی است، اما با انتخاب مناسب در شروع به شدت بر سرعت آن افزوده می‌شود [26]. بنابراین، با بررسی تنوع موجود، آگاهی از ساختار ژنتیکی جمعیت و بررسی تنوع فنوتیپی و ویژگی‌های شیمیایی می‌توان در بین توده‌های طبیعی به انتخاب، به‌عنوان اولین روش اصلاحی در طی اهلی‌کردن پرداخت [26]. تنوع ژنتیکی، کلیدی برای به‌نژادی گیاهان است. دانش روابط ژنتیکی بین توده‌های مختلف به مدیریت ژرم‌پلاسم کارآمد و استراتژی‌های بهره‌برداری کمک بزرگی می‌نماید. تنوع ژنتیکی گیاهان طی هزاران سال ایجاد شده و در طبیعت به صورت پایدار باقی مانده است [26].

ارقام بومی گیاهان زراعی و خویشاوندان وحشی آن‌ها، به دلیل قدمت و سازگاری‌شان به شرایط زیستی و عوامل نامسائد محیطی دارای مناسب‌ترین ژن‌ها بوده وتنوع ژنتیکی مورد نیاز اصلاح گیاه را تأمین می‌نماید [13]. تعیین میزان تنوع ژنتیکی در مواد گیاهی گام اولیه برای شناسایی، حفظ ونگهداری ذخایرتوارثی ونیز پایه اساسی و اولیه برای تحقیقات ژنتیکی و برنامه‌های اصلاحی می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد [27].

گیاه  Aegilops crassa،دارای دو سیتوتیپ تتراپلوئید وهگزاپلوئید با ژنوم ( 2n=2x=28 M^crM^crD^cr1D^cr1) و (2n=6x=42 M^crM^crD^cr1D^cr1 D^cr2D^cr2  ) است [44]. تجزیه جفت شدن کروموزوم‌های میوزی در هیبریدهای بین سیتوتیپ‌های تتراپلوئید وهگزاپلوئید Ae. crassa بیانگر آن است که فرم هگزاپلوئید از هیبریداسیبون بین فرم تتراپلوئید Ae. crassa و Ae. tauschii حاصل گردیده است. اما در حال حاضر منشأ سیتوتیپ تتراپلوئید Ae. crassa را نمی‌توان با دقت تعیین کرد [69]. گیاهی یکساله و متعلق به خانواده گرامینه^[1] یا پواسه^[2] و طایفه تریتیسه^[3] می‌‌‌‌‌‌‌‌‌‌باشد، این گونه به عنوان یک علف هرز شایع در مزارع گندم نان دیده می‌شود [57،56]. آژیلوپس کراسا در ترکیه، فلسطین، سوریه، اردن، ایران، عراق، لبنان، افغانستان، ترکمنستان و پامیر و کوه‌های آلتای پراکنده است، در ایران دارای دامنه پراکنش بسیار وسیعی بوده و از دامنه‌های البرز در شرق کشورتا شمال غرب در آذربایجان غربی وبر روی دامنه‌های رشته‌کوه زاگرس تا سواحل جنوبی در ارتفاعات استان بوشهر وهرمزگان می‌روید [101،40]. این گونه به عنوان یک منبع صفات مفید از قبیل تحمل به شوری، مقاومت به آفت و تحمل به سرما شناخته شده است [87،4]. مطالعه‌ی گونه‌های آژیلوپس در نقاط مختلف دنیا نشان می‌دهد که این گونه‌ها منابع ژنتیکی بی‌نظیری برای اصلاح گندم می‌باشند [33،17].

توده‌های بومی یک گیاه، ژرم‌پلاسم مناسبی برای برنامه‌های اصلاحی محسوب می‌شوند. بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان از طریق بررسی صفات مورفولوژیکی و بیوشیمیایی همواره متداول بوده است. باتوجه به اینکه اندازه‌گیری صفات مورفولوژیکی نیاز به صرف وقت، انرژی و هزینه زیادی دارد و به دلیل تاثیر عوامل محیطی بر بیان ژن و بروز صفات، بررسی تنوع ژنتیکی از طریق بررسی ویژگی‌های مورفولوژیکی روش قابل اعتمادی برای تعیین تفاوت‌های ژنتیکی نیست [8]. برای بررسی تنوع ژنتیکی می‌توان از نشانگرهای مورفولوژیکی، پروتئینی و نشانگرهای مولکولی استفاده نمود [113،102]. بررسی تنوع ژنتیکی در گیاهان، از طریق صفات مورفولوژیکی متداول بوده است [3]. با این وجود نشانگرهای مورفولوژیکی دارای معایب زیادی می‌باشند. از جمله این که تحت تأثیر شرایط محیطی و مرحله‌ی رشد موجود قرار می‌گیرند و پایداری کمی دارند [29]. بنابراین استفاده از نشانگرهای مولکولی یکی از ابزارهای بسیار مهم و قوی در زمینه بررسی تنوع ژنتیکی و انگشت نگاریDNA می‌باشدکه در ارزیابی روابط خویشاوندی ژنتیکی، انتخاب گیاهان برتر و بررسی شباهت یا تفاوت بین نمونه‌های مختلف کاربرد دارند [27]. همچنین استفاده از این نشانگرها در مدیریت ژرم‌پلاسم و انتخاب براساس نشانگر^[4] (MAS)، برای افزایش کارایی اصلاح و تکثیر ژرم‌پلاسم مفید می‌باشد [27]. انتخاب نوع نشانگرهای مولکولی به تکرارپذیری و سادگی روش کار آن بستگی دارد. بهترین نشانگری است که دارای هزینه اجرای پایین و قابلیت اعتماد بالایی باشد. نشانگرهای مولکولی به دو دسته نشانگرهای بیوشیمیایی و نشانگرهای مبتنی بر DNA تقسیم می‌شوند. [3]. نشانگرهای مبتنی بر DNA نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی و پروتئینی، کاربردی تر و دارای مزایای بیشتری می‌باشند. بررسی DNA گیاهی امکان ارزیابی مستقیم تنوع ژنتیکی را ممکن می‌سازد [3]. تاکنون تعداد زیادی از نشانگر‌های مبتنی بر DNA معرفی شده‌اند و در تجزیه‌های ژنتیک موجودات مورد استفاده قرار گرفته‌اند نشانگرهای مبتنی بر DNA نسبت به نشانگرهای مورفولوژیکی و پروتئینی، کاربردی تر و دارای مزایای بیشتری می‌باشند [28]. این نشانگر ها از نظر بسیاری از ویژگی‌ها از قبیل درجه چندشکلی^[5]، غالب^[6] یا هم بارز^[7] بودن، تعداد جایگاه‌های تجزیه‌شده در هر آزمایش، توزیع در سطح کروموزوم، تکرارپذیری، نیاز یا عدم نیاز به توالی‌یابی DNA الگو و هزینه مورد نیاز با همدیگر متفاوت‌اند [28]. نشانگرهایی که چند شکلی را در سطح DNA آشکار می‌نمایند، به عنوان یک ابزار قدرتمند برای توصیف و تنوع ژنتیکی شناخته شده‌اند [45]. نشانگرها با توجه به استراتژی پایه گروه‌بندی شده‌اند که مهمترین آن‌ها عبارتند از: روش‌های غیر مبتنی بر PCR (RFLP و …) و تکنیک‌های مبتنی بر PCR (RAPD، AFLP و ISSR و …).

                                                                                                                                                          

پایان نامه بررسی شاخص های پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری

پایان‌نامه جهت اخذ درجه کارشناسی‌ارشد
 رشته مهندسی کشاورزی
 عنوان:
بررسی شاخص­های پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری در چند رقم گیلاس

با فرمت قابل ویرایش word

تعداد صفحات: 90  صفحه

تکه های از متن به عنوان نمونه :

فهرست مطالب:

1- مقدمه و کلیات…………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-1- مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-2- اهداف…………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-3- فرضیه­ ها………………………………………………………………………………………………………………… 4

2- سابقه تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………….. 6

2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس………………………………………………………………………………… 6

2-2- طبقه­بندی ارقام گیلاس……………………………………………………………………………………………. 7

2-3- کیفیت میوه……………………………………………………………………………………………………………. 7

2-3-1- آنتوسیانین……………………………………………………………………………………………………. 7

2-3-2- اسیدیته………………………………………………………………………………………………………… 8

2-3-3- مواد جامد محلول…………………………………………………………………………………………. 8

2-3-4- سفتی بافت…………………………………………………………………………………………………… 9

2-3-5- کلروفیل و کاروتنوئید…………………………………………………………………………………….. 9

2-3-6- کربوهیدرات­ها……………………………………………………………………………………………. 10

2-4- بلوغ و رسیدگی در گیلاس……………………………………………………………………………………. 10

2-5- انبارمانی گیلاس…………………………………………………………………………………………………… 11

2-6- فیزیولوژی تنفس…………………………………………………………………………………………………… 12

2-7- اسید آبسیزیک……………………………………………………………………………………………………… 13

2-8- پیری……………………………………………………………………………………………………………………. 14

2-9- کنترل ژنتیکی متابولیسم گیاه…………………………………………………………………………………. 14

2-10- آنزیم آلفامانوزیداز و نقش آن در رسیدگی……………………………………………………………. 15

3- مواد و روش کار……………………………………………………………………………………………………….. 18

3-1- زمان و مکان آزمایش……………………………………………………………………………………………. 18

3-2- بخش بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………………. 18

3-2-1- مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………… 18

3-2-2- طرح آماری آزمایش……………………………………………………………………………………. 18

3-2-3- اندازه­گیری سفتی……………………………………………………………………………………….. 19

3-2-5- اندازه­گیری آنتوسیانین………………………………………………………………………………… 19

3-2-6- اندازه­گیری کلروفیل دم میوه……………………………………………………………………….. 19

3-2-7- اندازه­گیری مواد جامد محلول میوه……………………………………………………………… 21

3-2-8- اندازه­گیری اسیدیته قابل تیتراسیون میوه………………………………………………………. 21

3-2-9- اندازه­گیری قند…………………………………………………………………………………………… 21

3-2-9-1- مواد مورد نیاز………………………………………………………………………………….. 21

3-2-9-2- استخراج قند…………………………………………………………………………………….. 22

3-2-9-3- اندازه­گیری قند کل……………………………………………………………………………. 22

3-2-9-4- منحنی استاندارد قند کل……………………………………………………………………. 23

3-2-9-5- اندازه­گیری فروکتوز………………………………………………………………………….. 23

3-2-9-6- تهیه نمودار استاندارد فروکتوز……………………………………………………………. 24

3-3- بخش بیوتکنولوژی……………………………………………………………………………………………….. 25

3-3-1- مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………… 25

3-3-2- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………. 25

3-3-3- طراحی آغازگرها………………………………………………………………………………………… 26

3-3-4- تکثیر قطعات انتخابی………………………………………………………………………………….. 27

3-3-5- ارزیابی محصول PCR به وسیله تکنیک الکتروفورز ژل آگارز………………………… 28

3-3-6- توالی­یابی محصول PCR…………………………………………………………………………….. 28

3-4- تجزیه و تحلیل آماری……………………………………………………………………………………………. 28

4- نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………… 30

4-1- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر سفتی میوه گیلاس…………………………….. 30

4-2- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر تغییرات آنتوسیانین میوه گیلاس………… 33

4-3- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه گیلاس 36

4-4- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان مواد جامد محلول میوه گیلاس…. 42

4-5- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس 45

4-6- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان قند کل و فروکتوز میوه گیلاس…. 48

4-7- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 53

4-8- نتایج حاصل از طراحی آغازگر………………………………………………………………………………. 54

4-9- تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس……………………………………………………………… 54

4-10- بررسی نتایج حاصل از توالی­یابی و همردیف­سازی توالی­های بدست آمده……………….. 56

4-11- روابط فیلوژنی توالی­های مورد بررسی…………………………………………………………………. 60

4-12- نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………….. 61

4-13- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 62

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 64

چکیده:
 این کار تحقیقی در دو بخش بیوشیمیایی و بیوتکنولوژی در محل آزمایشگاه علوم باغبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شد. در بخش بیوشیمیایی، جهت بررسی تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر شاخص­های کیفی و روند پیری دو رقم زودرس و دیررس گیلاس، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی و در چهار تکرار صورت گرفت. تیمار اول، رقم (کرج و تکدانه) و تیمار دوم، اسید آبسیزیک (در دو غلظت صفر و ppm200) مورد بررسی قرار گرفتند. میوه­ها در فواصل زمانی پنج روز و طی مدت 20 روز از زمان برداشت، از لحاظ تغییرات صفات کیفی ارزیابی شدند. طبق نتایج بدست آمده، با گذشت زمان، سفتی در هر دو رقم کاهش یافته، و در نمونه­های تیمار شده با اسید آبسیزیک کاهش بیشتری نشان داد. میزان آنتوسیانین روند افزایشی داشت. میزان کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه­ها با گذشت زمان به طور معنی­داری کاهش یافت. مواد جامد محلول میوه­ها تا روز دهم کاهش و در روز پانزدهم افزایش پیدا کرد. اسیدیته میوه­ها روند نزولی داشت و در روز بیستم اختلاف معنی­داری بین نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده مشاهده شد. با گذشت زمان در میزان قند کل میوه­ها تغییر معنی­داری مشاهده نشد اما به طور کلی تغییرات قند کل دارای روند افزایشی بود. روند تغییرات فروکتوز برای نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک، در رقم کرج معنی­دار نبود اما بین رقم تکدانه تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک اختلاف معنی­داری در روز 15 و 20 مشاهده گردید. با توجه به این نتایج، می­توان نقش اسید آبسیزیک را در ایجاد تغییرات کیفی و همچنین تاثیر بر روند پیری میوه­ها، مورد توجه قرار داد. در بخش بیوتکنولوژی، ژن آلفامانوزیداز (یک ژن مرتبط با پیری) برای اولین بار، در پنج رقم مختلف گیلاس شناسایی و تعیین توالی شد. به این منظور، آغازگرهای رفت و برگشت ژن مورد نظر از طریق مراجعه به پایگاه داده NCBI و استفاده از توالی­های مربوط به ژن آلفامانوزیداز برای هلو و فلفل، با استفاده از کپی کامل cDNA هلو و فلفل طراحی شد. به علت زیاد بودن طول ژن سه جفت آغازگر طراحی شد گه این آغازگرها قادرند طول 3100 جفت­باز را پوشش دهند. همچنین دمای اتصال آغازگرها با استفاده از برنامه گرادیانت PCR بدست آمد. بعد از استخراج DNA ارقام گیلاس، یک قسمت از ژن مذکور تکثیر، توالی­یابی (با استفاده از نرم­افزار سنگر) و همردیف­سازی توالی­ها انجام شد و نمودار دندروگرام مربوط به آن با استفاده از نرم‌افزار 3 View رسم گردید. بررسی و مقایسه توالی­های معکوس، شباهت و تفاوت­هایی را در ارقام مختلف نشان داد که بر طبق آن ارقام پیش­رس (ER)، پیش­رس خارجی (FE) و دیررس (LR) دارای شباهت بیشتر بوده و در یک گروه قرار گرفتند. ارقام پیش­رس قزوین (GH) و دوم­رس (MR) دارای تفاوت بیشتری نسبت به سه رقم اول بوده و با یکدیگر نیز تفاوت نشان داده و هرکدام به طور جداگانه یک گروه مجزا را تشکیل دادند.این تفاوت­ها می­توانند در عملکرد ژن و در نتیجه رفتار گیاه تاثیرگذار باشند. به عنوان مثال، با مطالعات بیشتر و استفاده از تکنیک­های مهندسی ژنتیک، می­توان علت زمان­های متفاوت رسیدگی و تفاوت در طول عمر انبارمانی موجود در ارقام مختلف گیلاس را در این اختلاف توالی‌ها جستجو نمود. فصل اول: مقدمه و کلیات 1- مقدمه و کلیات 1-1- مقدمه از دیرباز پدیده­ی عمر یکی از مسائل مهم حیات بوده است. از این­رو افزایش عمر برای موجودات گیاهی، جانوری و یا انسان می­تواند حائز اهمیت باشد. پیری در گیاهان به عنوان مرحله­ی نهایی نمو تعریف شده است. از مشخصه­های بارز پیری کنترل روند تغییرات بسیار منظم و کنترل شده فعل و انفعالات فیزیولوژیکی است. از جمله مهمترین این رخدادها توقف فتوسنتز، تجزیه کلروپلاست، کاهش چشمگیر کلروفیل و شکستن پروتئین­ها و لیپید­ها و سایر مولکول­های بزرگ می­باشد (نواب پور و همکاران، 2003). در میوه­های فرازگرا اتیلن عامل اصلی پیر شدن میوه می­باشد و کنترل اتیلن از مکانیسم­های اصلی جلوگیری از پیری در این میوه­ها است. اما گیلاس یک میوه­ی نافراز­گرا است. این میوه دارای ارقام متفاوتی از نظر طول عمر می­باشد که شناسایی عوامل دخیل در تعیین طول عمر در ارقام زودرس و دیررس می­تواند منجر به افزایش طول عمر گیلاس گردد. طی رسیدن میوه، دسته­ای از فرآیندهای بیوشیمیایی که از لحاظ ژنتیکی در گیاه برنامه­ریزی شده­اند رخ می­دهد که باعث تغییر ویژگی­های میوه‌ی نارس و تبدیل آن به میوه‌ی رسیده می‌شود (برامل، 2006). همچنین بعد از برداشت محصولات، تغییرات مختلف ساختاری ادامه می­یابند که در جهت تخریب بافت میوه عمل می­کنند (یو و همکاران، 2003). نرم شدن بیش از حد میوه­ها مساله­ای است که عمر پس از برداشت آنها را کاهش می­دهد. در محصولات تراریخته با تغییر در بیان ژن پروتئین­ها و آنزیم­هایی که بر ویژگی­های دیواره­ی سلولی تاثیرگذار هستند، می­توان میزان فعالیت و تاثیر آنزیم­هایی مثل پلی گالاکتوروناز را در روند رسیدگی و نرم شدن محصول بررسی کرد (برامل و هارپستر، 2001 و واکابایاشی، 2000). نرم شدن و تغییرات بافتی طی رسیدن میوه­ها در هر گونه­ی خاص، ویژگی­های مخصوص به خود را داراست (برامل و همکاران، 2004). علاوه بر این، تحقیقات نشان داده است که آنزیم­های آلفامانوزیداز (α-Man) و بتادی ان استیل هگزوسامینیداز (ß -Hex) در رسیدگی و نرم شدن میوه­های نافراز­گرا نقش دارند (قوش و همکاران، 2010). با توجه به نافراز­گرا بودن میوه­ی گیلاس، مشخص نیست که بین ارقام زود­رس و دیر­رس این میوه چه بخشی از ژن­های α-Man و ß-Hex و ژن توسعه­ی سلولی (EXP) باعث تفاوت در طول عمر انباری گیلاس­های زود­رس و دیر­رس می­گردد. همچنین مشخص نمی­باشد که شاخص­های پیری بین دو رقم زود­رس و دیر­رس چه تفاوتی از نظر فعالیت­های آنزیمی α-Man و ß -Hex، لیپاز، پروتئاز و همچنین مقادیر قند، مواد جامد محلول، نشاسته، ساکارز سینتئاز و اینورتاز در طی دوران رسیدگی و پیری دارند. تفاوت الگوی ژنی این آنزیم­ها در سطح ژنومیک نیز مشخص نیست. در این پژوهش، توالی­ یک ژن­ نامزد عامل پیر شدن به نام آلفامانوزیداز از پایگاه اطلاعاتی ژنوم هلو و فلفل استخراج گشت. بر اساس توالی به دست آمده و کاربرد نرم افزار پرایمر3، توالی پرایمرهای اختصاصی مناسب برای تکثیر این ژن نامزد، طراحی و سپس ساخته شد و ژن­ مربوطه از DNA ژنومیک گیلاس استخراج و به کمک دستگاه ترموسایکلر و روش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر و سپس به کمک دستگاه توالی­یاب تعیین توالی شد. در مرحله­ی بعد با کاربرد نرم­افزار پاپ ژن، توالی به­دست آمده برای ژن­ استخراج شده و ارقام زود­رس و دیر­رس مورد مقایسه قرار گرفت و اختلافات موجود از نظر حذف تک نقطه­ای و یا قطعه­ای و یا اضافه شدن ارزیابی شد. در این تحقیق اثر اسید آبسیزیک نیز بر شاخص­های پیری مورد بررسی قرار گرفت. 2-1- اهداف 1- تشخیص تفاوت­های توالی ژن­ مذکور (α-Man) بین دو رقم زود­رس و دیررس و تشخیص هرگونه تفاوت در توالی هر تک نوکلئوتید یا موتاسیون تک نقطه­ای و مقایسه­ی این ژن­ها بین ارقام گیلاس زود­رس با انبارداری پایین و دیر­رس با انبارداری بالا 2- مقایسه­ شاخص­های پیری بین این دو رقم گیلاس زود­رس و دیر­رس 3- تعیین تغییرات گلوکز، فروکتوز در زمان رسیدگی و پیری و طیف تغییرات آنها در میوه گیلاس 3-1- فرضیه ها 1- ارقام گیلاسی که دیر­رس و دارای طول عمر انبار­داری زیادتر هستند، دارای تفاوت در توالی ژن­ مربوطه می­باشند که این احتمالا مربوط به منطقه دومین آنزیم می­باشد. 2- کاربرد هورمون اسید آبسیزیک در ارقام دیر­رس باعث بروز پیری با تاخیر بیشتری نسبت به ارقام زود­رس می­گردد.